利用HPLC-FLD對大鼠5-HT含量測定實驗分析的藥學(xué)本科畢業(yè)論文

　　1 儀器和試劑

　　美國Waters高效液相色譜儀（ 510泵， 474熒光檢測器， 717自動進(jìn)樣器及柱溫控箱等）；Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；瑞士Mettler萬分之一、十萬分之一及百萬分之一電子天平；美國Milli-Q純水器；三洋MDF-382E超低溫冰箱，Beckman 21R高速冷凍離心機(jī)，上海金達(dá)生化儀器廠XUF-1高速分散器。

　　5-羥色胺（5-HT）標(biāo)準(zhǔn)品（1357359 33907213 美國Fluka公司）；甲醇為江蘇漢邦科技有限公司的色譜純甲醇；其它試劑均為分析純。

　　2 方法

　　2.1 色譜條件色譜柱為Alltima C18（4.6 mm×250 mm,5 μm），流動相為0.1 mol/l磷酸二氫鉀溶液-甲醇（9∶1 V/V）；單泵等度洗脫；流速1.0 ml/min，；λEx:254 nm；λEm:338 nm；柱溫：35℃。

　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1 mol/L鹽酸制成0.35 mg/ml的對照品貯備液，避光冷藏保存。按實際檢測需要，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋到相應(yīng)的溶度，供檢測用。

　　2.3 大鼠海馬腦組織勻漿樣品的制備取大鼠海馬組織，稱濕重，以1∶10的比例加入0.4 mol/L的高氯酸，（即每100 mg腦組織加1 ml 0.4 mol/L的高氯酸）。冰浴下充分勻漿，冰浴沉淀30 min，于4℃，10 000 r·min-1離心15min，取上清液，每毫升上清液加0.75 ml 4%的碳酸氫鈉溶液、混勻后，于4℃、3 000 r·min-1離心5 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，分裝，于-80℃保存待用。

　　3 結(jié)果

　　3.1 標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液的色譜分離圖在選定的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品液與按“2.3”項下方法處理的樣品分別進(jìn)樣的色譜圖見圖1～2，從圖中可知，5-HT 峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，其保留時間為9.9 min。

　　3.2 線性范圍、檢出限采用外標(biāo)法，取0.7 μg·ml-1的5-HT標(biāo)準(zhǔn)液在選定的色譜條件下分別進(jìn)樣1，3，6，9，12 μl，以峰面積Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量X（ng）為橫坐標(biāo)作圖，檢測線性范圍為0.70～8.40 ng（r=0.999 9）；峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系；以信噪比為 3（S/N =3）時，計算檢出限為1.27×10-3 ng。

　　3.3 精密度、重復(fù)性實驗在上述色譜條件下，取濃度為0.7 μg·ml-15-HT的標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)測定5次，測得日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%，表明實驗方法精密度良好。

　　取同一樣品平行5份，按“2.3”項下方法處理，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察樣品峰面積的重復(fù)性，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%。表明實驗方法具有很好的重復(fù)性。

　　測定方法選擇本文對5-HT含量檢測比較了高效液相-電化學(xué)（HPLC-ECD）和HPLC-FLD，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用HPLC-ECD方法時，檢測器對流動相的改變較敏感，使系統(tǒng)不易穩(wěn)定。最終選擇了高效液相分析中高分辨率，高靈敏度的熒光檢測法。建立了適用于檢測5-HT物質(zhì)簡單、快速、重復(fù)性好的HPLC-FLD。在探索該測定方法時，作者觀察到海馬組織樣品的處理要快，制備好的待測樣品要保存在-80℃冰箱內(nèi)，這對得到良好的分析結(jié)果至關(guān)重要。

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